Kromatografi
cairan kolom klasik merupakan prosedur pemisahan yang sudah mapan dalam
mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat lewat kolom karena
gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang rendah
dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969,
perhatian dalam teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok
karena dikembangkannya sistem tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber,
yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2
(3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3
mm) dengan partikel pendukung berukuran sekitar 30 μm dan eluen
dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm3m-1).
Pemisahan dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100
kali lebih cepat) daripada dengan kromatografi cairan yang biasa.
Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak mahal.
Kromatografi
Cair Tekanan Tinggi, HPLC merupakan bentuk kromatografi kolom yang
sering digunakan dalam biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan,
mengidentifikasi, mengukur dan memanjang. HPLC memanfaatkan kolom yang
memegang chromatographic bahan kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa
yang bergerak selular fase (s) melalui kolom, dan detektor yang
menunjukkan ingatan waktu Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung
pada interaksi antara keadilan tahap, yang Molecules yang dianalisis,
dan larutan (s) yang digunakan.
Kromatografi
jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan
tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam,
tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan.
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas-liquid chromatography (GLC), maka HPLC lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak stabil.
ANALISIS HPLC
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC
adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya
diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari
masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua
hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama
adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses
identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam
keberhasilan proses analisa.
Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.
Penentuan Kualitatif
HPLC
digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk
identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel
dibandingkan dengan larutan standar.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
o Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
o Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
o Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
- Berdasarkan area kromatogram
- Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Hasil
analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis
komponen dalam sample.
Sample
yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram
dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk
(overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan
konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan
tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat
aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.
Kesulitan
biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang
terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan
milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan
kromatogram standard. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi
adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang
sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik
analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama,
dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem
HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan
zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.
Jadi,
melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat.
Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram.
Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika
spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
Beberapa parameter penting yang perlu diperhatikan di dalam analisis HPLC adalah :
A. Kolom
Sebuah
kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang
dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Kolom yang biasa
digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi
dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui
pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara
sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut
polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam
kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi
tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang
berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam
larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa
non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus
hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa
ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan
ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam
molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya,
senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan
bergerak lambat dalam kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan
bergerak lebih cepat melalui kolom.
Ada
kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18
yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan
sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa
tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat
(Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-,
polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh
pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
B. Komposisi Eluen
Komposisi
eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam
eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan
pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni
metanol.
C. Volume Injeksi
Sampel
yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau
manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai
sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi
sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik),
step-flow injection, dan sampling value.
D. Detektor
Detektor
merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik
kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding
kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat
digunakan.
Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :
o Berdasarkan
pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh molekul
sampel maupun fase gerak (bulk property detector).Detektor dapat
dibedakan menjadi :
• Detektor Indeks Bias
Detektor
indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah
detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias
fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen
sampel, sehingga dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada
HPLC. Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet
dan sangat peka terhadap perubahan suhu.
• Detektor konduktivitas
• Detektor tetapan dielektrika
o Berdasar
pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut
solute property detector).Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :
1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak,
• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)
Pada
detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan pada
absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar tampak
(untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor yang
paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya yang
tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan untuk
pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi dengan
pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV yang digunakan
dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang diukur. Walaupun
demikian, biasanya panjang gelombang UV yang digunakan adalah pada 254
nm karena kebanyakan senyawa organic menyerap sinar UV pada sekitar
panjang gelombang tersebut.
Detektor
fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC. Dengan detektor
ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari komponen sampel sehingga
gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.
• Detektor Polarografi dan radioaktif;
Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..
E. Chart Speed
Diagram kecepatan dapat diketahui bila sampel diinjeksikan secara manual.
2.2 APLIKASI HPLC
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
1) HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2) Zat-
zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4) Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5) Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6) Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
0 komentar:
Posting Komentar