Penentuan Kadar Protein

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).

Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius pada tahun 1838.

Biosintesis protein alami sama dengan ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa DNA ditranskripsi menjadi RNA, yang berperan sebagai cetakan bagi translasi yang dilakukan ribosom. Sampai tahap ini, protein masih "mentah", hanya tersusun dari asam amino proteinogenik. Melalui mekanisme pascatranslasi, terbentuklah protein yang memiliki fungsi penuh secara biologi.

Langkah awal dalam pemurnian protein ialah menentukan bahan alamyang akan diproses. Penentuan ini didasarkan pada kadar protein yang ada didalamnya. Tentu saja dipilih bahan alam yang mempunyai kadar protein yang tinggi dan mudah diperoleh. Analisis terhadap kadar protein dalam bahan alam tersebut perlu dilakukan untuk memperoleh data tentang kadar protein yang akan dimurnikan. Bila protein yang diinginkan tahan terhadap panas, campuran protein dapat dipanaskan sebentar untuk mengendapkan protein lain yang diinginkan. Disamping itu protein juga sensitif terhadap asam dan basa dengan konsentrasitinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan pada pH mendekati netral dengan menggunakan buffer tertentu. Setelah diperoleh larutan yang berisi beberapa macam protein maka proses selanjutnya ialah fraksionasi, yaitumemisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi. Dua cara yang biasa digunakan untuk proses fraksionasi ini yaitu pengendapan dan kromatografi. Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode yang mana bergantung dari jenis sample dan ketersediaan alat serta bahan. Metode yang  umum digunakan adalah metode Kjeldahl, Lowry dan Biuret. Metode yang juga digunakan adalah metode Lowry. Pada metode ini protein dengan asam fosfotungstat-fofomolibdat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi proteinyang tertera. Konsentrasi protein yang diukur berdasarkan optikal density pada panjang gelombang 600 nm (OD terpilih). Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, lebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara Bovine Serum Albumin (BSA) atau albumin serum darah sapi. LarutanLowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstat-fosfomolibdat (1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-karbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-K-Tartrat 2%. Cara penentuannya adalah 1 mL larutan protein ditambah 5 mL Lowry B, dokocok dan dobiarkan selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,5 mL Lowry A, dikocok dan dibiarkan 20 menit, selanjutnya diamati OD-nya pada panjang gelombang 600 nm. Cara Lowry ini 10-20 kali lebih sensitif dari pada cara UV atau cara Biuret. Beberapa metode yang juga sering digunakan antara lain :

1.    Metode spektrofotometer UV Kebanyakan protein mengabsorsi sinar ultraviolet maksimum pada 280 nm. Hal ini terutama untuk mengidentifikasi adanya asam amino tirosin, triptophan dan fenilalanin yang ada pada protein tersebut. Pengukuran protein berdasarkan absorpsi sinar UV adalah cepat, mudah dan tidak merusak bahan. Untuk keperluan perhitungan digunakan pula kurva standar.

2.    Metode turbidimetri atau kekeruhanMetode ini didasarkan pada kekeruhan yang terbentuk pada larutan yang mengandung protein apabila ditambahkan bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic acid (TCA), kalium ferri sianida [K₄Fe(CN)₆] atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat turbidimeter. Cara ini hanya dapat dipakai untuk bahan protein yang berupa larutan dan hasilnya biasanya kurang tepat.

3.  Metode pengecatanBeberapa bahan pewarna misalnya orange G. Orange 12 dan Amido Black dapat membentuk senyawaan berwarna dengan protein dan menjadi tidak larut. Dengan mengukur sisa bahan pewarna yang tidak bereaksi dalam larutan (dengan kolorimeter), maka jumlah protein dapat ditentukan dengancepat.

4.    Penentuan protein dengan titrasi formal Larutan protein dinetralkan dengan basa (naOH), kemudian ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam (gugus karboksil) dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah PP, akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam30 detik. Titrasi formol ini hanya tepat untuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat untuk penentuan protein.

STRUKTUR

Struktur protein dapat dilihat sebagai hirarki, yaitu berupa struktur primer (tingkat satu), sekunder (tingkat dua), tersier (tingkat tiga), dan kuartener (tingkat empat):

• struktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Frederick Sanger merupakan ilmuwan yang berjasa dengan temuan metode penentuan deret asam amino pada protein, dengan penggunaan beberapa enzim protease yang mengiris ikatan antara asam amino tertentu, menjadi fragmen peptida yang lebih pendek untuk dipisahkan lebih lanjut dengan bantuan kertas kromatografik. Urutan asam amino menentukan fungsi protein, pada tahun 1957, Vernon Ingram menemukan bahwa translokasi asam amino akan mengubah fungsi protein, dan lebih lanjut memicu mutasi genetik.
• struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Berbagai bentuk struktur sekunder misalnya ialah sebagai berikut:
• alpha helix (α-helix, "puntiran-alfa"), berupa pilinan rantai asam-asam amino berbentuk seperti spiral;
• beta-sheet (β-sheet, "lempeng-beta"), berupa lembaran-lembaran lebar yang tersusun dari sejumlah rantai asam amino yang saling terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H);
• beta-turn, (β-turn, "lekukan-beta"); dan
• gamma-turn, (γ-turn, "lekukan-gamma").
• struktur tersier yang merupakan gabungan dari aneka ragam dari struktur sekunder. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener.
• contoh struktur kuartener yang terkenal adalah enzim Rubisco dan insulin.

Struktur primer protein bisa ditentukan dengan beberapa metode: (1) hidrolisis protein dengan asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino acid analyzer, (2) analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan degradasi Edman, (3) kombinasi dari digesti dengan tripsin dan spektrometri massa, dan (4) penentuan massa molekular dengan         spektrometri massa.

Struktur sekunder bisa ditentukan dengan menggunakan spektroskopi circular dichroism (CD) dan Fourier Transform Infra Red (FTIR). Spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans negatif pada 208 dan 220 nm dan lempeng-beta menunjukkan satu puncak negatif sekitar 210-216 nm. Estimasi dari komposisi struktur sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD. Pada spektrum FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita amida-I dari lempeng-beta. Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein juga bisa diestimasi dari spektrum inframerah.

Struktur protein lainnya yang juga dikenal adalah domain. Struktur ini terdiri dari 40-350 asam amino. Protein sederhana umumnya hanya memiliki satu domain. Pada protein yang lebih kompleks, ada beberapa domain yang terlibat di dalamnya. Hubungan rantai polipeptida yang berperan di dalamnya akan menimbulkan sebuah fungsi baru berbeda dengan komponen penyusunnya. Bila struktur domain pada struktur kompleks ini berpisah, maka fungsi biologis masing-masing komponen domain penyusunnya tidak hilang. Inilah yang membedakan struktur domain dengan struktur kuartener. Pada struktur kuartener, setelah struktur kompleksnya berpisah, protein tersebut tidak fungsional.

Keuntungan Protein

• Sumber energi
• Pembetukan dan perbaikan sel dan jaringan
• Sebagai sintesis hormon,enzim, dan antibodi
• Pengatur keseimbangan kadar asam basa dalam sel

Posted in: